Эндонуклеазы рестрикции

Эндонуклеазы рестрикции, рестриктазы (от лат. restrictio — ограничение, следует отказаться от термина "рестриктаза", как вульгаризованного) — группа ферментов, относящихся к классу гидролаз, катализирующих реакцию гидролиза нуклеиновых кислот.

В отличие от (экзонуклеаз), эндонуклеазы рестрикции расщепляют нуклеиновые кислоты не с конца молекулы, а в середине. При этом каждый такой фермент узнаёт определённый участок ДНК (сайт) длиной от четырёх пар нуклеотидов (возможно вырождение) и расщепляет нуклеотидную цепь внутри участка узнавания или вне его.

Защита бактериального генома от собственной эндонуклеазы рестрикции осуществляется, как правило, с помощью метилирования нуклеотидных остатков аденина и цитозина (маскирования).

При проведении дайджеста в неоптимальных условиях (особенно при превышении концентрации фермента) эндонуклеазы проявляют (звёздчатую активность) (снижение специфичности рестрикции).

Классификация

Выделяют три основных типа (или класса) ферментов рестрикции, для которых могут быть симметричными ((палиндромными)) и несимметричными:

• Эндонуклеазы рестрикции первого типа (например, ЕсоК из Escherichia coli К12) узнают определённую последовательность нуклеотидов и разрезают двуцепочную молекулу ДНК неподалёку от этой последовательности в произвольной точке, и само место разреза не строго специально (по-видимому, после образования комплекса с ДНК фермент неспецифически взаимодействует с удалённой областью ДНК или передвигается вдоль цепи ДНК). Обладают рестриктазной, метилазной и АТФазной активностями.
• Эндонуклеазы рестрикции второго типа (например, EcoRI, (XbaI)) узнают определённую последовательность и разрезают двойную цепь ДНК в определённой фиксированной точке внутри этой последовательности. Эндонуклеазы рестрикции этого типа узнают (палиндромные) последовательности, которые обладают центральной осью и считываются одинаково в обе стороны от оси симметрии. Не обладают АТФазной активностью.
• Эндонуклеазы рестрикции третьего промежуточного типа (например, EcoPI) узнают нужную последовательность и разрезают двуцепочную молекулу ДНК, отступив определённое число нуклеотидных пар от её конца (или в нескольких точках на разном удалении от сайта узнавания). При этом образуются фрагменты ДНК либо с ровными (тупыми) концами, либо с выступающими (липкими) 5'- или 3'-концами. Эти эндонуклеазы рестрикции узнают асимметричные сайты. Эти их свойства широко используются в различных методах сборки ДНК in vitro, как, например, (сборка Golden Gate). Эти эндонуклеазы рестрикции обладают рестриктазной,метилазной и АТФ-азной активностями

К 2007 году выделено более трёх тысяч эндонуклеаз рестрикции. Более шестисот эндонуклеаз рестрикции доступны в виде коммерческих препаратов и повседневно используются в лабораториях для модификации ДНК и решения генно-инженерных задач.

Номенклатура рестриктаз

С момента их открытия в 1970-х годах было идентифицировано множество ферментов рестрикции; например, охарактеризовано более 3500 различных ферментов рестрикции типа II. Каждый фермент назван по имени бактерии, из которой он был выделен, с использованием системы наименований, основанной на роде, виде и штамме. Например, название фермента рестрикции EcoRI было получено, как показано в приведенной таблице:

Разбор названия рестриктазы EcoRI
Часть аббревиатуры	Значение	Что описывает
E	Escherichia	родовое название
co	coli	видовое название
R	RY13	штамм
I	Первая	порядок идентификации в бактерии

Изошизомеры, гетерошизомеры и изокаудомеры

Изошизомеры — это пары эндонуклеаз рестрикции, имеющих специфичность к распознаванию одинаковых последовательностей, но иногда отличающихся по наличию (метилированных нуклеотидных остатков), и разрезающих эти последовательности в одинаковых местах. Например, изошизомерами являются рестриктазы (CGTAC^G) и (CGTAC^G). Первый выделенный фермент для узнавания и специфического разрезания заданной последовательности, называют прототипом, а все остальные подобные рестриктазы называют изошизомерами.

Изошизомеры выделяют из разных штаммов бактерий и поэтому разные изошизомеры могут требовать разных условий реакции.

Гетерошизомеры (неошизомеры)

Фермент, узнающий такую же последовательность, но разрезающий её по-другому, называют гетерошизомером (неошизомером). Например, рестриктазы (GGG^CCC) и (G^GGCCC) являются гетерошизомерами, но не изошизомерами друг для друга.

Изокаудомеры

Эндонуклеазы рестрикции, распознающие совершенно разные последовательности, но образующие одинаковые концы, называют изокаудомерами.

Искусственные рестриктазы

В генной инженерии широко используются искусственные эндонуклеазы рестрикции, получаемые путём слияния ДНК-связывающего домена (цинкового пальца) с ДНК-разрезающим доменом нуклеазы. Домен цинкового пальца может быть спроектирован так чтобы узнавать и связываться с желаемой последовательностью ДНК. Альтернативой нуклеазам с цинковым пальцем являются искусственные ферменты рестрикции TALEN, получаемые путём слияния ДНК-связывающего домена TAL-эффектора с доменом расщепления ДНК.

Эндонуклеазы, работающие по «наводке» РНК

Для редактирования генома в клетках человека используются также эндонуклеазы системы (CRISPR)-(Cas9), расщепляющие определённые последовательности ДНК по «наводке» комплементарной РНК. В отличие от цинковых пальцев и TALEN, системе CRISPR-Cas для узнавания ДНК требуется только создание соответствующей последовательности РНК «гида», а не создание новых белковых доменов фермента, что делает этот метод гораздо более доступным благодаря простоте и сравнительной дешевизне.

Перспективной видится разработка (Fanzor) – гомологов (CRISPR)-(Cas9), обнаруженных у .

Значение

В практической молекулярной биологии чаще всего используются эндонуклеазы рестрикции II типа, сайт узнавания для которых в большинстве случаев представляет собой (палиндром). Все эндонуклеазы рестрикции II типа — Mg²⁺-зависимы.

Эндонуклеазы рестрикции — часть сложной (системы рестрикции-модификации), используемой бактериальными клетками для регуляции содержания и активности ДНК в клетке.

Открытие эндонуклеаз рестрикции в 1970-х годах вместе с разработкой способов секвенирования ДНК послужило основным толчком для развития генетической инженерии.

В настоящее время эндонуклеазы рестрикции с различными сайтами узнавания являются основным инструментом генетических исследований и генной инженерии.

См. также

• (Система рестрикции-модификации)
• (Футпринтинг ДНК)
• (REBASE)
• (CRISPR-Cas13)
• (Хронология биотехнологии)

Примечания

1. Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Робертс К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки: в трех томах. — 2. — Москва: Мир, 1994. — Т. 1. — 517 с. — 10 000 экз. — .
2. Айала Ф. Д. Современная генетика. 1987.
3. Roberts R. J., Vincze T., Posfai J., Macelis D. REBASE--enzymes and genes for DNA restriction and modification (англ.) // ^[англ.] : journal. — 2007. — Vol. 35, no. Database issue. — P. D269—70. — doi:10.1093/nar/gkl891. — PMID 17202163.
4. Primrose, Sandy B.; Old, R. W. Principles of gene manipulation: an introduction to genetic engineering (англ.). — Oxford: (Blackwell Scientific), 1994. — .
5. Micklos, David A.; Bloom, Mark V.; Freyer, Greg A. Laboratory DNA science: an introduction to recombinant DNA techniques and methods of genome analysis (англ.). — Menlo Park, Calif: Benjamin/Cummings Pub. Co, 1996. — .
6. Adrianne Massey; Helen Kreuzer. Recombinant DNA and Biotechnology: A Guide for Students (англ.). — Washington, D.C: ^[англ.], 2001. — .
7. Carroll, D. (2011) Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics, 188(4), 773—782. doi:10.1534/genetics.111.131433
8. Fujii W, Kano K, Sugiura K, Naito K (2013) Repeatable Construction Method for Engineered Zinc Finger Nuclease Based on Overlap Extension PCR and TA-Cloning. PLoS ONE 8(3): e59801. doi:10.1371/journal.pone.0059801
9. Zhu, C., Gupta, A., Hall, V. L. et al. & Wolfe, S. A. (2013). Using defined finger-finger interfaces as units of assembly for constructing zinc-finger nucleases. Nucleic acids research, 41(4), 2455-246541 doi:10.1093/nar/gks1357.
10. Mussolino, C., & Cathomen, T. (2012). TALE nucleases: tailored genome engineering made easy. Current Opinion in Biotechnology, 23(5), 644—650 doi:10.1016/j.copbio.2012.01.013
11. Beumer, K. J., Trautman, J. K., Christian, M.,et al. & Carroll, D. (2013). Comparing Zinc Finger Nucleases and Transcription Activator-Like Effector Nucleases for Gene Targeting in Drosophila. G3: Genes| Genomes| Genetics, 3(10), 1717—1725 doi:10.1534/g3.113.007260
12. Sun, N., & Zhao, H. (2013). Transcription activator‐like effector nucleases (TALENs): A highly efficient and versatile tool for genome editing. Biotechnology and bioengineering, 110(7), 1811—1821 doi:10.1002/bit.24890
13. Zhang Z, Zhang S, Huang X, Orwig KE, Sheng Y (2013) Rapid Assembly of Customized TALENs into Multiple Delivery Systems. PLoS ONE 8(11): e80281. doi:10.1371/journal.pone.0080281
14. Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., & Kim, J. S. (2013). Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature biotechnology, 31, 230—232. doi:10.1038/nbt.2507
15. Hsu, P. D., Scott, D. A., Weinstein, J. A.,et al. & Zhang, F. (2013) DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology, 31(9), 827—832. doi:10.1038/nbt.2647
16. Golic, K. G. (2013) RNA-Guided Nucleases: A New Era for Engineering the Genomes of Model and Nonmodel Organisms. Genetics, 195(2), 303—308. doi:10.1534/genetics.113.155093
17. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., et al. & Zhang, F. (2013). Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature protocols, 8(11), 2281—2308 doi:10.1038/nprot.2013.143
18. Giedrius Gasiunas, Virginijus Siksnys (2013) RNA-dependent DNA endonuclease Cas9 of the CRISPR system: Holy Grail of genome editing? от 5 декабря 2013 на Wayback Machine Trends in Microbiology, 21(11), 562—567, doi:10.1016/j.tim.2013.09.001
19. Luhan Yang, Prashant Mali, Caroline Kim-Kiselak, and George Church (2014) CRISPR-Cas Mediated Targeted Genome Editing in Human Cells. In: Gene Correction. Methods and Protocols. Series: Methods in Molecular Biology, Vol. 1114 Storici, Francesca (Ed.)
20. Uri Ben-David (2013) Flowing through the CRISPR-CAScade: Will genome editing boost cell therapies? от 17 ноября 2015 на Wayback Machine Molecular and Cellular Therapies 2013, 1:3 doi:10.1186/2052-8426-1-3
21. Neena K. Pyzocha, F. Ann Ran, Patrick D. Hsu, and Feng Zhang (2014) RNA-Guided Genome Editing of Mammalian Cells. In: Gene Correction. Methods and Protocols. Series: Methods in Molecular Biology, Vol. 1114 Storici, Francesca (Ed.)
22. Li, M., Suzuki, K., Kim, N. Y., Liu, G. H., & Belmonte, J. C. I. (2013). A cut above the rest: targeted genome editing technologies in human pluripotent stem cells. Journal of Biological Chemistry, jbc-R113. doi:10.1074/jbc.R113.488247
23. Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., & Zhang, F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity (англ.) // Science : journal. — 2016. — Vol. 351, no. 6268. — P. 84—88. — doi:10.1126/science.aad5227.
24. Kleinstiver B. P., Pattanayak V., Prew M. S., , & J. Keith Joung et al. High-fidelity CRISPR–Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects (англ.) // Nature : journal. — 2016. — doi:10.1038/nature16526.
25. Makoto Saito, Peiyu Xu, Guilhem Faure, Samantha Maguire, Soumya Kannan, Han Altae-Tran, Sam Vo, AnAn Desimone, Rhiannon K. Macrae, Feng Zhang. Fanzor is a eukaryotic programmable RNA-guided endonuclease (англ.) // Nature. — 2023-08. — Vol. 620, iss. 7974. — P. 660–668. — ISSN 1476-4687. — doi:10.1038/s41586-023-06356-2. 29 июня 2023 года.